天京变乱和石达开出走使太平军被迫由战略进攻转向防御，清军乘机反扑，攻占了长江中下游许多地方，重建江南、江北大营，围困天京。洪秀全为了挽救颓势，提拔陈玉成、李秀成等青年将领，委以重任。1858年8月，陈玉成、李秀成会集各路将领，在安徽枞阳召开军事会议。各路大军协同作战，一举攻破浦口歼敌万余，再次击溃江北大营。11月，在安徽三河镇全歼湘军精锐6000余人，迫使清军从安庆撤围，稳定了天京上游的局势。
1859年，洪仁玕提出《资政新篇》：主张“权归于一”，反对“结党联盟”；提出广开言路，“上下情通”；效法西方，兴办工矿交通和金融事业；准许私人投资，雇佣劳动；奖励民间制造器皿技艺，准其专利自售；遵循中外自由通商，平等往来；兴办学馆，建立医院，设立社会福利机构。《资政新篇》作为太平天国后期的政治纲领，具有明显的资本主义倾向。1860年上半年，李秀成、陈玉成部捣毁江南大营，并开辟了苏南根据地。1861年9月安庆失陷，次年5月陈玉成败走寿州，被俘就义，太平天国西线陷入无法挽救的危境。
第二次鸦片战争后，外国侵略者同清政府互相勾结，共同镇压太平天国。太平天国坚决地同侵略者进行英勇斗争，先后重创“常胜军”、“常安军”、“常捷军”，并将“常胜军”头目华尔击毙，给侵略者以沉重打击。安庆失陷之后，太平军在江苏、浙江的根据地也相继失守，只剩下天京及其周围小块地区，这时，天京内无粮草，外无援兵，形势日益危急。李秀成提出“让城别走”、另辟根据地的主张，被洪秀全拒绝。1864年6月1日，洪秀全病逝。7月19日，湘军挖掘地道，用火药轰塌城墙，经过激烈巷战，天京陷落。大部分太平军将士壮烈牺牲，少数人突围。幼天王和洪仁玕在江西被俘，英勇就义。李秀成在天京突围时被俘，被曾国藩杀死。太平军余部转战大江南北，一直奋战到1868年。
中国历史上这场空前规模的太平天国农民战争，前后奋战14年，纵横18省，威震全中国，最终在清政府和外国侵略势力的联合绞杀下失败了。